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本试剂盒采用比色法测定多酚氧化酶（PPO）的活性，测定原理如下：多酚氧化酶能够催化底物酚产生醌，后者在420 nm处有特征性光吸收，可根据颜色深浅进行比色定量。

该方法的优点包括快速简便，适用于检测动物血清/浆、组织、细胞等样本中的多酚氧化酶(PPO)活力。

产品信息

组分信息

备注：试剂一为混悬液，使用前需混均匀，否则结果会有偏差。

使用说明

1.仪器试剂准备

含420 nm 波长的分光光度计、1 cm光径比色皿、37℃水浴锅或恒温箱、台式低速离心机、各种规格移液器、双蒸水、研钵、涡旋混匀器、试管或离心管、蛋白测定试剂。

2.样本前处理

1）组织样本：

组织称重（g）：提取液体积（mL）为1:5或1:10的比例（例如0.2 g组织加1 mL提取液或0.1 g组织加1 mL提取液），进行冰浴匀浆，8000转/分钟，常温离心10分钟（或4000转/分钟，离心10分钟后取上清再4000转/分钟离心10分钟），取上清待测。注意取部分上清液于90℃以上沸水浴中反应5分钟作为除非处理的粗酶液上清。

2）血清/浆或果汁样本：

取血清/浆或果汁体积（mL）：提取液体积（mL）为1:4或1：9的比例（例如取0.2 mL 血清/浆或果汁加入0.8 mL 提取液，或者取0.1 mL血清/浆或果汁加入0.9 mL提取液），涡旋混匀抽提1分钟；8000 转/分钟，常温离心10分钟（或4000转/分钟，离心10分钟后取上清再4000转/分钟离心10分钟），取上清待测。注意取部分上清液于90℃以上沸水浴中反应5分钟作为除非处理的粗酶液上清。

3）细菌或细胞样本：

称重法：提取时可以先取离心管用万分之一天平称重，再收集细菌或细胞到离心管内，1000转/分钟，离心5分钟后弃上清，再次称重，减去空离心管重量，再按2 mg：1000 μL或1 mg：1000 μL的比例加入提取液，超声破碎（冰浴，功率200 W，超声3秒、间隔10秒，重复30次），8000转/分钟，4℃离心10分钟，取上清待测，结果按照组织计算方法计算。

细胞个数法：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量104个：提取液体积为500～1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1 mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200 W，超声3秒、间隔10秒，重复30次）8000转/分钟，4℃离心10分钟，取上清待测，结果按照组织计算方法计算。

粗酶液提取完，吸出一部分在90℃以上水浴中煮沸5分钟，取出流水冷却，作为对照管煮沸的上清用。

3.操作表

备注：

每个待测样本需设定一个测定管和一个对照管；用离心管测定时，最好提前在盖上扎一小孔防止管盖弹开；分光光度计预热30分钟以上。

4.计算公式

1）组织、细菌或细胞PPO活性

① 按样本鲜重计算：

单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使在420 nm处吸光度值变化0.01为一个酶活力单位。

PPO活力(U/g组织)= (△A/0.01)×(V提/W)×(V反总/V样)×(1/V反总)​÷ T

其中，V提：表示提取液总体积，mL；W：表示样本质量，g；V反总：表示反应体系总体积，0.9 mL；V 样：表示取样量，0.15 mL；T：表示反应时间，10 min。

② 按蛋白浓度计算：

单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使在420 nm处吸光度值变化0.01为一个酶活力单位。

PPO活力(U/mgprot) = (△A/0.01)×(V反总/V样)×(1/V反总)​÷ T ÷ Cpr

其中，W：表示样本质量，g；V反总：表示反应体系总体积，0.9 mL；V样：表示取样量，0.15 mL；T：表示反应时间，10 min；Cpr：表示样本蛋白浓度，mgprot/mL（prot 指蛋白）。

③ 按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使在420 nm处吸光度值变化0.01为一个酶活力单位。

PPO活力(U/104细胞)} = (△A/0.01)×(V提/q细胞)×(V反总/V样)​×(1/V反总)÷ T

其中，V提：表示提取液总体积，mL；q细胞：表示细胞总数，104个；V反总：表示反应体系总体积，0.9 mL；V样：表示取样量，0.15 mL；T：表示反应时间，10min。

2）血清/浆或果汁PPO活性

单位定义：每分钟每mL血清/浆或果汁在每mL反应体系中使在420 nm处吸光度值变化 0.01为一个酶活力单位。

PPO活力(U/mL) = (△A/0.01)×(V提/q细胞)×(V反总/V样)​×(1/V反总)÷ T

其中，V提：表示提取液总体积，mL；V液：表示血清/浆或果汁体积，mL；V反总：表示反应体系总体积，0.9 mL；V样：表示取样量，0.15 mL；T：表示反应时间，10 min。

2～8℃保存，有效期3个月。