Protocol：利用Tn5转座酶使用电穿孔法构建细菌突变体库
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2026-05-14
构建Tn5转座子突变体文库主要有两种方式：
体外电穿孔法（转座体法） ：将预组装的Tn5转座体复合物通过电穿孔直接转入目标细菌，转座体在细胞内自发完成整合。该方法操作简便、转化效率高。
体内接合法（pUT自杀质粒法） ：利用携带Mini-Tn5转座子的pUT自杀质粒，通过供体菌（如E. coli S17-1 λpir）与受体菌进行接合转移，转座子随机插入基因组后筛选稳定整合的突变体。
本文介绍了电穿孔法构建细菌突变体库的详细实验步骤：
体外电穿孔法（基于Tn5转座体）实验步骤
一、实验材料与试剂
试剂清单：
◼ Tn5转座酶（12914ES）；
◼ SOC培养基——用于电转后复苏细菌。
◼ LB（10216ES）培养基——细菌培养。
◼ 选择性抗生素——根据转座子携带的抗性标记选择，如四环素（Tc，100 μg/mL，60212ES）或卡那霉素（Kan，50 μg/mL，60206ES）。
◼ 0.3 M蔗糖溶液（60350ES）——用于洗涤感受态细胞。
◼ 96孔微孔板（84015ES）和DMSO（7%，60313ES）——用于突变体保存。
◼ 甘油Glycerol(100%，714419ES)——用于转座子复合物的长期保存。
菌株准备：
目标细菌（受体菌）需培养至对数生长期（OD600 ≈ 0.5-0.8）并制备为电转感受态细胞。
二、 详细实验步骤
步骤1：制备电转感受态细胞
a. 取目标细菌过夜培养物，按1:100接种至新鲜LB培养基（10216ES），37℃振荡培养至OD600 ≈ 0.5-0.6；
b. 将菌液置于冰上冷却10分钟，随后4℃离心（4,000 × g，10分钟）收集菌体；
c. 用等体积冰冷的0.3 M蔗糖（60350ES）溶液重悬菌体，重复洗涤2次；
d. 将洗涤后的菌体重悬于1/100原体积的0.3 M蔗糖（60350ES）中，分装为100 μL/管，置于冰上备用。
步骤2：转座子准备
a. Tn5转座子的设计。
Tn5转座子是两侧带有19bp ME序列的DNA片段，可以使用含有ME序列的上下游引物进行PCR合成。为了获得最佳的转座效率，在两端的PCR引物中需要添加一个5'磷酸基团。
典型的Tn5转座子参考图1。
ME序列：5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'
得到的转座子的正义链序列：
5'-CTGTCTCTTATACACATCT+目的基因（抗性标记）+AGATGTGTATAAGAGACAG-3'
图1：Tn5转座子示意图。Tn5转座子其两端为19bp ME序列，ME序列可被Tn5转座酶特异性识别。
b. 按照下表依次加入相应试剂，制备Tn5转座体复合物。
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成分 |
用量 |
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Tn5 Transposon DNA(100 μg/mL in TE Buffer，步骤2a) |
2 μL |
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Tn5转座酶(12914ES，40 μM) |
4 μL |
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Glycerol(100%,714419ES) |
2 μL |
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总反应体积 |
8 μL |
① 本反应无须Mg2+催化，请勿使用5×Reaction Buffer。
② 参考a中Tn5的转座子设计，Tn5 Transposon DNA为含选择标记(如抗性标记)、成对识别序列(如ME序列)和目标基因的双链DNA，可通过PCR等方法获得。
③本反应体系可根据实际需要进行放大或缩小。
步骤3：电穿孔导入转座体
a. 取100 μL电转感受态细胞（约含1010个细胞），加入0.7 μL 步骤2b中制备的Tn5转座体复合物（浓度约为20 ng/μL），轻吹混匀；
b. 将混合物转移至预冷的1 mm电转杯中；
c. 使用电转仪在以下参数下进行电穿孔：2.5 kV，10 μF，600 Ω；
d. 电击后立即向电转杯中加入1 mL预冷的SOC培养基，轻轻吹打混匀，转移至无菌试管中；
e. 37℃振荡复苏培养1.5 hour，使细菌充分表达抗性基因。
步骤4：突变体筛选
a. 复苏培养1.5 hour后，将菌液分别涂布于含选择性抗生素的LB平板（10216ES）（如四环素（Tc，100 μg/mL，60212ES）或卡那霉素（Kan，50 μg/mL，60206ES））；
b. 37℃倒置培养24-48 hour，直至出现单个菌落；
c. 随机挑取单个菌落转移至96孔板，每孔预加150 μL含7% DMSO的LB（10216ES）液体培养基（含相同抗生素），在-80℃冰箱中保存备用。
步骤5：文库质量检测
a. 随机选取若干突变体，提取其基因组DNA；
b. 使用转座子内部引物和随机引物进行反向PCR（Inverse-PCR）或单引物PCR（SP-PCR），扩增转座子旁侧序列；
c. 对PCR产物进行测序，确定转座子插入位点；
d. 进行Southern blot杂交，确认各个突变体中转座子的插入拷贝数，确保片段为单拷贝插入。
三、关于体外转座的补充说明（特别适用于DNA转化法）
对于某些转化效率较低的细菌（如嗜热菌Thermus thermophilus），可考虑以下变通方法：
将Tn5转座体与1 μg目标细菌的基因组DNA混合孵育后，用DNA聚合酶补齐转座后产生的单链缺口（该步骤对某些细菌至关重要）。之后将处理后的DNA直接转化（如自然感受态菌株）或电转至目标细菌。具体步骤如下：
a. 按照下表制备转座子插入混合物。配制过程中需要注意目标DNA纯度，确保无外源核酸污染。
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成分 |
用量 |
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5×Reaction Buffer |
2 μL |
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Target DNA |
0.2 μg |
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Tn5 Transposon（步骤a中获得的序列） |
x μL |
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HC Fast Tagmentase（12914ES） |
1 μL |
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ddH2O |
至10 μL |
*为了避免多余片段的插入，需要计算反应中使用的目标DNA摩尔数，并加入等摩尔量的Tn5转座子片段以减少产生过多插入的可能性。μmol target DNA=μg target DNA/[(base pairs in target DNA)×660]，例如：0.2 μg 5000bp的目标DNA = 0.2 μg/[5000bp×660]=0.06×10-6μmol = 0.06 pmol。
b. 混后37℃孵育2 hour。
c. 加入2 μL 5×Stop Buffer，混匀后55℃孵育10分钟终止反应。
d. （可选）taq酶补齐单链缺口：转座后体系加taq酶（13344ES），72℃延伸3 min。
e. 取1 μL混合物电击转化到感受态细胞中，根据抗性标记筛选阳性菌株。未使用的混合物可以-20℃保存。推荐的电击转化条件：50 μL感受态细胞，1 μL混合物，2毫米电击杯，2500V，电击时间5毫秒。转化条件可根据该条件的转化效果进行优化。转座的克隆数主要取决于所转化的宿主细胞、内源性的限制修饰系统及感受态细胞的转化效率。
*参考文献：
1. Microbial Transposon Mutagenesis: Protocols and Applications, Ricke SC, Park SH, Davis ML, Eds. Springer。
2. Construction of transposon mutant library. etunde YA, et al. Bio-protocol Exchange, 2020。
产品列表
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实验步骤 |
产品名称 |
产品货号 |
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DNA提取 |
MolPure® Bacterial DNA Kit |
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转座酶 |
Hieff®HC Fast Tagmentase |
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Taq酶/Tn-seq建库 |
2× Ultima HF Amplification Mix |
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LB培养基 |
LB Powder预混培养基 |
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抗生素 |
四环素 |
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卡那霉素 |
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纯化磁珠 |
Hieff NGS®DNA Selection Beads |
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Qubit定量 |
1× dsDNA HS Assay Kit |
