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背景介绍

多能干细胞具有无限增殖能力和分化为机体所有功能细胞类型的潜能，是再生医学、药物筛选及疾病建模的核心“种子细胞”。传统诱导多能干细胞（iPSCs）依赖外源转录因子导入，存在插入突变、伦理争议等安全隐患，限制其临床应用[1]。小分子化合物可通过精准调控细胞命运相关信号通路，实现成体细胞向多能干细胞的化学重编程，具有操作简便、时空调控性强、无外源基因整合等优势[2]，打破了传统诱导技术的瓶颈。近年来，高分文献报道的小分子组合诱导体系，不仅大幅提升了重编程效率，还解决了多能干细胞发育潜能不足的问题，为其临床转化奠定了基础[1][2]。

培养方案

本方案参考高分文献优化，操作简便、重复性强，适合入门级培养，核心依赖小分子化合物组合调控细胞重编程，全程需在无菌环境下进行。

1.  细胞准备：选用人成纤维细胞作为起始细胞，培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，每2-3天传代一次，确保细胞活力≥90%，避免细胞衰老影响重编程效率[1]。

2.  接种培养：将成纤维细胞接种至无菌6孔板，培养至细胞汇合度达70%-80%，更换无血清培养基饥饿培养12小时，为诱导做准备[2]。

3.  小分子诱导：加入含小分子化合物的诱导培养基——第0-3天添加10 μM BrdU、3  μM CHIR-99021和2μM Repsox，第4-7天加入10 μM BrdU、3μM  CHIR-99021和5μM Forskolin，精准调控重编程过程[2]；第8天起更换多能干细胞维持培养基，持续培养。

4.  培养维护：置于37℃、5% CO₂培养箱中，每2天更换一次培养基，10-14天可出现多能干细胞克隆，18-22天完成成熟多能干细胞诱导[1]。

5.  观察鉴定：通过倒置显微镜观察克隆形态，采用免疫荧光染色检测Oct4、Sox2等多能性标志物表达，验证诱导有效性[1][2]。

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参考文献

[1] Deng H K, et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells[J]. Nature, 2022, 604(7906): 532-538. 

[2] Xie X, et al. BrdU enables full chemical induction of induced pluripotent stem cells[J]. Cell Research, 2015, 25(8): 919-932.