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（一）常用细胞膜荧光探针
 

DiI, DiO, DiD, DiR是一系列亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。这些环境敏感性荧光染料在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强。且具有消光系数高、极性依赖性、激发态寿命短等特点。一旦进入细胞膜后，可在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。

不同的荧光染色（DiI橙色荧光；DiO绿色荧光；DiD红色荧光；DiR深红色荧光）为活细胞多标、流式分析提供了便利：

1）DiO和DiI可分别用标准的FITC滤光片和TRITC滤光片检测。

2）DiD是DiI的衍生物，具有明显往红光迁移的激发和发射光谱，可以被633 nm He-Ne激光激发，并且具有比DiI更长的激发和发射光波长，这一特性使其特别适合标记具显著自荧光效应的细胞或组织。

3）DiR具强效的近红外光穿透细胞或组织，并在近红外区具较低的自荧光水平，这些特性使其特适用于体内成像或示踪实验。

• 显微镜检测

(1)     DiD，DiO，DiI，DiR激发波长与发射波长：

(2)多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：

　a) DiI和DiO=Omega XF52，Chroma 51004;

　b) DiI和DiD=Omega XF92，Chroma 51007;

　c) DiI，DiO和DiD=Omega XF93，Chroma 61005

• 流式细胞仪的检测

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS 染色的细胞可以分别用经典的FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测。

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 （二）细胞示踪——红色荧光探针CM-DiI 
 

CM-Dil通过与膜结构的脂质分子结合而标记细胞，有着强而稳定的红色荧光（激发峰553nm/发射峰570nm）。

 与Dil不同，它水溶性更好，所以对于细胞染色更为方便有效；它的CM基团（即氯甲基替代基团）能与多肽及蛋白上的巯基反应从而使该分子在醛类物质中保持稳定，所以CM-Dil标记细胞后再进行固定、破膜及石蜡包埋操作都不会影响其荧光，是免疫荧光、免疫组化和原位杂交中理想的细胞荧光标记染料。

 另外，CM-DiI 对细胞无毒，且稳定长效，能很好地长期示踪细胞。研究证实，CM-DiI标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达98%以上，标记细胞形态良好，能有效地观察细胞在体外的诱导分化情况；或将标记的细胞注入体内，可以有效的显示移植细胞在活体组织中的迁移及分化。

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（三）细胞增殖示踪——绿色荧光探针CFDA SE
 

CFDA SE的全称为Carboxyfluorescein diAcetate, succinimidyl ester，是一种近年来被广泛应用的细胞增殖检测用荧光探针，也可以用于细胞的荧光示踪。

基于CFDA SE荧光标记的细胞增殖检测和[3H]-thymidine掺入、BrdU标记获得的检测结果完全一致，但同时可以提供更多的细胞增殖信息。使用CFDA SE检测可以提供整个细胞群中有多少比例的细胞分裂了1次、2次或更多次数，同时如果和其它荧光探针联用，可以获取不同分裂次数细胞的其它相关信息。

CFDA SE可以通透细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的酯酶(esterase)催化分解成CFSE，CFSE可以偶发性地(spontaneously)并不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其它氨基发生结合反应，并标记这些蛋白。在加入荧光探针CFDA SE后大约24小时，即可充分标记细胞。被CFDA SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数个月。CFDA SE标记细胞的荧光非常均一，比以前使用的其它细胞示踪荧光探针例如PKH26的荧光更加均一，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均匀。

由于CFDA SE标记细胞的荧光非常均匀和稳定，每分裂一次子代细胞的荧光会减弱一半，这样通过流式细胞仪检测就可以检测出没有分裂的细胞，分裂一次的细胞(1/2的荧光强度)，分离两次的细胞(1/4的荧光强度)，分裂三次的细胞(1/8的荧光强度)以及类似的其它分裂次数的细胞。分裂次数较多后，分裂0次或1次等没有分裂或分裂次数较少的细胞会逐渐减少直至检测不到。CFDA SE标记细胞呈绿色荧光，检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为518nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。CFDA SE标记的细胞也可以用荧光显微镜进行观察。

CFDA SE标记的细胞无论在体外还是体内都不会使邻近细胞染色。即CFDA SE荧光探针完成标记后不会从一个细胞转移到邻近细胞。

目前CFDA SE标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测。常用于淋巴细胞的增殖检测，也可以用于成纤维细胞、NK细胞等其它细胞的增殖检测，甚至还可以用于细菌增殖的检测。

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